樣品制備已成為冷凍電鏡技術(shù)解析生物樣品高分辨率結(jié)構(gòu)的主要限速步驟。在這個過程中，氣液界面效應(yīng)、背景噪音和優(yōu)勢取向等問題可能導致冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析失敗，或者重復性較差。石墨烯，因其低背景噪音、高機械強度和高導電性等出色特性，被用作冷凍電鏡樣品制備支撐膜以提升樣品質(zhì)量。

2024年1月22日，清華大學/北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心王宏偉課題組和北京大學彭海琳課題組合作開發(fā)了一種基于石墨烯“三明治” 結(jié)構(gòu)的冷凍電鏡生物樣品制備方法，以“石墨烯三明治技術(shù)用以生物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析”（Graphene sandwich-based biological specimen preparation for cryo-EM analysis）為題發(fā)表于《美國科學院院報》（Proceedings of the National Academy of Sciences，PNAS）期刊。該研究通過在兩層石墨烯間封裝生物樣品溶液，制備冰層厚度適宜的石墨烯“三明治”樣品（圖1），用以高分辨冷凍電鏡重構(gòu)。

常規(guī)石墨烯膜制備冷凍電鏡樣品的方法能夠增加顆粒吸附，減輕氣液界面帶來的干擾。然而，石墨烯支持膜僅存在于冰層一側(cè)，不能消除另一側(cè)氣液界面對樣品的影響；并且在支撐膜親水性不佳時，容易出現(xiàn)樣品脫水的現(xiàn)象（圖1A）。為解決這一問題，研究團隊開發(fā)了一種石墨烯“三明治”技術(shù)，在生物樣品溶液兩側(cè)都鋪設(shè)石墨烯支持膜，對生物樣品進行封裝，進而制備冷凍電鏡樣品，從而徹底避免氣液界面等問題的影響（圖1B）。

圖1. 采用石墨烯作為支持膜的冷凍電鏡樣品制備示意圖

在制備石墨烯“三明治”樣品的過程中，先將生物樣品溶液滴加到石墨烯電鏡載網(wǎng)上，然后再將另一層石墨烯轉(zhuǎn)移覆蓋至上述載網(wǎng)表面。為解決上層石墨烯易于卷曲破碎而不便轉(zhuǎn)移的問題，研究團隊采用硬脂酸分子輔助石墨烯自支撐地懸浮在緩沖液表面，后將其轉(zhuǎn)移至滴加樣品溶液的石墨烯載網(wǎng)上。這種方法能夠高成功率、高重復率地實現(xiàn)石墨烯“三明治”結(jié)構(gòu)封裝樣品溶液。

和常規(guī)單側(cè)石墨烯膜支撐的冷凍樣品相比（圖1a），這種石墨烯“三明治”結(jié)構(gòu)有助于補償因電子束照射而損失的二次電子，減小冷凍樣品在透射電鏡下的電荷積累效應(yīng)。并且，由于石墨烯優(yōu)異的機械強度，該方法還可以有效防止冰層形變，降低電鏡成像過程中的顆粒漂移，從而進一步提高冷凍電鏡照片的質(zhì)量。采用這種方法制備冷凍樣品，研究團隊成功獲得了成像質(zhì)量更高的冷凍電鏡數(shù)據(jù)，解析了去鐵鐵蛋白、20S蛋白酶體和新冠病毒刺突蛋白的高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖2. 石墨烯“三明治”結(jié)構(gòu)應(yīng)用于冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析

清華大學/北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心王宏偉教授、北京大學化學與分子工程學院彭海琳教授和清華大學生命學院劉楠博士為該論文的共同通訊作者，清華大學生命學院2019級博士生徐潔、北京大學化學與分子工程學院2020級博士生高嘯寅、北京大學化學與分子工程學院鄭黎明博士為該論文共同第一作者，清華大學生命學院2020級博士生賈霞、清華大學生命學院徐魁博士、北京大學工學院韋小丁教授及其研究生馬瑜薇為該工作提供重要幫助。該課題得到了國家蛋白質(zhì)科學研究（北京）設(shè)施清華基地冷凍電鏡平臺和計算平臺的大力協(xié)助和國家自然科學基金、騰訊基金會以及清華大學水木學者計劃的支持。

文章鏈接:https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2309384121

文章來源：公眾號“北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心”